活體成像研究底物之：

Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）

——活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉(zhuǎn)錄水平研究

搜索關(guān)鍵詞：

Luc reporter gene 報(bào)告基因；Luciferase 螢火蟲熒光素酶；In vivo imaging 活體成像研究；熒光素酶/ATP水平研究；報(bào)告基因質(zhì)粒；報(bào)告基因bing毒顆粒；螢火蟲熒光素；甲蟲熒光素；CAS：103404-75-7；

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化 來指示能量或生命體征。

基本應(yīng)用：

1. 體內(nèi)活體成像In vivo imaging；

2. 體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報(bào)告基因分析；高通量測(cè)序和各種污染檢測(cè)。

常見商業(yè)化類型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場(chǎng)上常見的有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內(nèi)的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)應(yīng)用上都沒有實(shí)質(zhì)性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒有差別，主要是使用習(xí)慣等因素影響。整體來看，鉀鹽的應(yīng)用文獻(xiàn)明顯多于鈉鹽。

使用方法【體內(nèi)成像/腹腔注射】

由于D-熒光素進(jìn)入體內(nèi)的生物分布非?？焖偾覄?dòng)力學(xué)具組織依賴性，因此，研究人員需正式實(shí)驗(yàn)前確定自身動(dòng)物在D-熒光素注射后的成像采集zuijia時(shí)間。通過建立動(dòng)物模型的熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線來完成。

一．動(dòng)力學(xué)曲線建立（Kinetic curve）

1.1 如下腹腔注射（i.p.）D-熒光素。傾向于注射清醒小鼠，如果需要在注射前麻醉小鼠，也是可以的，但可能會(huì)稍微延長動(dòng)力學(xué)（熒光素酶表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)）。

1.2 等待三分鐘，然后按照自身選擇的方法如氣體麻醉或注射麻醉。

1.3 將麻醉動(dòng)物置于成像腔內(nèi)，D-luciferin注射約5min后拍*張照片。

1.4 每隔5-10min采集圖像zui高40min，建立模型相關(guān)的熒光素酶表達(dá)動(dòng)力曲線。使用2%異氟烷的麻醉健康動(dòng)物能在活體成像系統(tǒng)如IVIS內(nèi)安全放置45min。

1.5 一旦建立曲線后能確定zuijia的信號(hào)采集點(diǎn)。大部分的模型都是在D-熒光素注射10-20min后采集圖像。

二．D-熒光素溶液準(zhǔn)備

2.1 用無菌的PBS（w/o Mg²⁺）或者DPBS（w/o Mg²⁺）配制D-熒光素（鈉鹽/鉀鹽）儲(chǔ)存液（15mg/ml，根據(jù)動(dòng)物體重和單次注射體積來決定），0.2µm濾膜過濾除菌。混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2.2 注射150mg/kg體重。（比如，體重10g小鼠注射100μl 15mg/ml的儲(chǔ)存液從而給1.5mg D-熒光素）；

2.3 于成像前5-15min腹腔注射D-熒光素。

【注意】：對(duì)每只動(dòng)物模型需要建立D-熒光素動(dòng)力學(xué)曲線研究，以確定熒光素注射后達(dá)到信號(hào)峰值的時(shí)間點(diǎn)。

三．腹腔注射（i.p.）

應(yīng)用示例【生物化學(xué)發(fā)光體內(nèi)成像】

Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

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